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近日，清華大學(xué)精密儀器系尤政教授團隊提出了基于點陣激光激發(fā)方法的高通量流式成像方法。該方法可實現(xiàn)低成本、高可擴展性的成像流式細胞儀，而且首次驗證了全光譜成像流式技術(shù)。相關(guān)成果以“Imaging flow cytometry using linear array spot excitation”為題在期刊《Device》上發(fā)表，并被選為當期封面文章。

研究背景與成果

流式和顯微鏡是細胞檢測的兩個基本工具。流式技術(shù)具有高通量和豐富的分子檢測信息，但缺乏細胞形態(tài)信息；相反，熒光顯微鏡可以提供細胞影像信息，但檢測通量低，難以獲取足夠的樣本數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。自流式細胞儀問世以來，其發(fā)展趨勢一直在于保持高檢測通量的同時增加更多信息維度，例如空間形態(tài)信息或光譜信息，以實現(xiàn)更準確的細胞分析或分選。成像流式技術(shù)是一種整合了流式細胞儀高檢測通量和熒光顯微鏡空間分辨能力的儀器。然而，由于成像通量、分辨率和檢測靈敏度之間的基本矛盾，現(xiàn)有的成像流式技術(shù)通常采用復(fù)雜的光路系統(tǒng)、復(fù)雜的圖像重構(gòu)算法，同時成像可擴展性也很有限。這使得成像流式細胞儀難以達到像傳統(tǒng)流式細胞儀那樣的高檢測通道數(shù)，并且其高昂的技術(shù)成本限制了應(yīng)用范圍。

為解決這些問題，清華大學(xué)精儀系尤政教授課題組提出了一種基于點陣激光激發(fā)的成像方法，即Linear spot array excitation（LASE）。該方法的核心思想是使用點陣結(jié)構(gòu)光斑替代傳統(tǒng)流式細胞儀中的橢圓或條狀光斑，從而賦予流式細胞儀成像能力。

圖1：點陣激光激發(fā)成像原理示意圖

圖1展示了該成像方法的工作原理。在檢測區(qū)域中，激發(fā)光斑呈一串等間隔的點陣光斑，由衍射光學(xué)器件生成，光斑間隔大于細胞大小，并且其排列直線與細胞運動直線呈一定的小角度。當細胞依次通過照明光斑時，將產(chǎn)生一串熒光和散射光信號。在圖像重構(gòu)階段，只需通過信號的分割和重組即可重建細胞圖像。該方法具有實現(xiàn)簡單、實時重建的優(yōu)勢，并且與現(xiàn)有流式細胞儀光路結(jié)構(gòu)兼容，因此具有良好的可擴展性，能夠在高檢測通量的基礎(chǔ)上，同時實現(xiàn)多激光、多熒光通道以及無標記成像。

技術(shù)成果展示

圖2. 雙激光五通道成像流式系統(tǒng)

圖3.細胞器進行成像與細胞周期研究

本研究利用基于LASE成像方法構(gòu)建了一個成像系統(tǒng)，具備2色激光（488nm/638nm）和5個成像通道（明場、FITC、PE、PI、APC），如圖2A所示。該系統(tǒng)經(jīng)驗證在30×30μm的成像視場下，具有1.3μm的空間分辨率。當細胞樣本以5m/s的流速經(jīng)過探測區(qū)域后，系統(tǒng)能夠進行無標記的明場成像和熒光成像，且不會出現(xiàn)運動模糊，成像通量最高可達每秒5000個細胞每秒。該系統(tǒng)不僅能夠?qū)毎械募毎鹘Y(jié)構(gòu)進行成像（見圖3A），而且可以在多個熒光波段下，實現(xiàn)對不同細胞結(jié)構(gòu)的同時成像（見圖3B）。在生物學(xué)應(yīng)用中，圖像被廣泛視為金標準，因為它能夠為細胞分析提供更為豐富和準確的信息，從而更細致準確地進行細胞分型。舉例來說，通過圖像，可以在傳統(tǒng)流式基礎(chǔ)上更進一步區(qū)分細胞周期M期的細胞核形態(tài)，如圖3C所示。

圖4. 32通道全光譜成像流式驗證

得益于LASE成像方法的高度可擴展性，本論文將成像熒光信號引入一個基于棱鏡色散的32通道光譜儀中，初步驗證了全光譜成像流式細胞儀的可行性。該系統(tǒng)在保持每秒5000個細胞的檢測速度通量的同時，能夠同時在32個光譜通道上對細胞進行成像。借助光譜分解算法，可以有效解決多染料檢測實驗中染料光譜混疊效應(yīng)的問題，將成像流式細胞儀的理論可檢測染料數(shù)擴展至30以上的量級。這將大大提高成像流式細胞儀給單細胞分析帶來的信息量。

成果優(yōu)勢

該研究提出的點陣激光激發(fā)的成像方法，具有以下優(yōu)勢：

1、系統(tǒng)簡單：采用衍射器件在傳統(tǒng)流式細胞儀基礎(chǔ)上進行光斑整形，即可實現(xiàn)高通量成像功能，相較于已有成像流式技術(shù)，具備顯著的成本優(yōu)勢。

2、圖像重建復(fù)雜度低：可實現(xiàn)實時重建，進一步可用于基于圖像的實時細胞分選。

3、可擴展性強：該技術(shù)可搭配多個激光和更多的檢測通道，也可結(jié)合光譜檢測實現(xiàn)全光譜成像，使成像流式細胞儀達到與傳統(tǒng)流式細胞儀和光譜流式細胞儀相當?shù)目蓹z測標記數(shù)量。

該技術(shù)提供的高通量和信息量將有效為細胞病理學(xué)、多組學(xué)、藥物篩選、液體活檢、單細胞測序等研究領(lǐng)域提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。

該研究的第一完成單位為清華大學(xué)精密儀器系。中國工程院院士、清華大學(xué)精密儀器系教授尤政，斯坦福大學(xué)研究科學(xué)家趙精晶(原精儀系博士生）為該論文的共同通訊作者。精儀系博士畢業(yè)生韓勇、趙精晶為該文的共同第一作者。精儀系博士畢業(yè)生晁子翕、焦?jié)珊猓珒x系博士生張馳、姜凌奇等為該論文共同作者。該研究得到了國家自然科學(xué)基金、生物醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)及儀器北京實驗室的資助。

論文鏈接：

https://www.cell.com/device/fulltext/S2666-9986(23)00183-7#secsectitle0070